3.   Determinazione gas-cromatografica di antiparassitari

L’immissione in commercio di un principio attivo da impiegarsi come antiparassitario necessita di un autorizzazione che viene rilasciata dal Ministero della Sanità a seguito di valutazioni sulla pericolosità per l’uomo e per l’ambiente. Parallelamente al rilascio dell’autorizzazione il Ministero produce un elenco di coltivazioni per le quali è consentito l’uso del principio attivo e un elenco dei prodotti alimentari freschi o trasformati, destinati all’alimentazione umana o animale, sui quali ne è tollerata la presenza e i relativi limiti massimi consentiti.
Le analisi per il controllo del rispetto delle disposizioni di legge è affidato ai laboratori ufficiali, tra i quali operano quelli dei Presidi Multizonali di Prevenzione (PMP).
All’interno del PMP di Reggio Emilia la determinazione di antiparassitari viene effettuata con tecnica gas-cromatografica. Il metodo, messo a punto sulla base di varie pubblicazioni, prevede una prima fase di estrazione dalla matrice con etile acetato, solvente appropriato per diversi antiparassitari, una fase di purificazione mediante Gel Permeation Chromatography (GPC) e la successiva determinazione gas-cromatografica. La GPC ha il vantaggio, rispetto ad altre tecniche di purificazione precedentemente utilizzate, di isolare nella stessa frazione sia componenti polari che apolari. Il metodo nel suo insieme consente quindi la determinazione contemporanea di antiparassitari appartenenti a classi chimiche diverse, tra cui: composti clororganici, fosforganici, azotoorganici, solforganici, piretroidi.

3.1  IL METODO SECONDO LO SCHEMA ISO/TC 34 N° 948

La scrittura della procedura d’analisi in forma standardizzata è indispensabile trattandosi di un metodo interno al laboratorio. Di seguito se ne riporta una stesura provvisoria. Lo schema a cui ci si è riferiti è l’ISO/TC 34 n° 948 indicato dall’Istituto Superiore di Sanità nel documento "Linee guida per l'assicurazione della qualità nei laboratori preposti al controllo ufficiale dei prodotti alimentari".

Titolo

Determinazione multiresiduo di insetticidi e fungicidi in frutta e verdura con tecnica gas-cromatografica.

Scopo e campo di applicazione

Il metodo permette la determinazione dei residui dei seguenti principi attivi:

sulle seguenti matrici ortofrutticole:

Riferimenti

Il metodo è stato messo a punto in laboratorio partendo dalle metodiche descritte nelle seguenti pubblicazioni:

Principio

Il metodo si basa su una fase di estrazione dei principi attivi con etile acetato, una successiva purificazione dell’estratto con Gel Permeation Chromatography (GPC) e conclusiva analisi gas-cromatografica.

Reattivi e materiali

I solventi utilizzati nelle fasi del metodo sono tutti di grado di purezza specifico per pesticidi.

Apparecchiature

Preparazione del campione

Le modalità di preparazione del campione per l’analisi sono descritte nell’apposita procedura operativa.

Procedimento

Omogenizzazione ed estrazione

Nella bottiglia per Omni-Mixer si pesano 50 g. del campione preparato per l’analisi. In un cilindro graduato da 250 ml si misurano 150 ml di etile acetato e si versano nella bottiglia contenente il campione. Si lascia a temperatura ambiente per non meno di 4 ore e per non più di 24. Si monta la bottiglia sull’Omni-Mixer e si aziona il coltello regolandolo ad una velocità di 2500 giri/minuto. Dopo 5 minuti si spegne, si aggiungono 25 g. di solfato di sodio anidro, si riaccende e si prosegue per altri 5 minuti.
Nel Buckner si ricopre l’interno con il filtro da filtrazione rapida su cui si versano 30 gr di solfato di sodio anidro. Si colloca il Buckner su un pallone da 250 ml e vi si versa l’estratto omogeneizzato. Si lava con due aliquote da 50 ml di etile acetato.
Si monta il pallone su Rotavapor regolando la temperatura del bagnomaria a 35 °C e il vuoto a 180 mbar. Si concentra a piccolo volume senza tirare a secco. L’estratto concentrato viene poi tirato a secco sotto cappa in corrente di azoto.

Purificazione

Si riprende l’estratto con 10 ml, misurati con pipetta tarata da 10 ml di grado A, di eluente per GPC. Per l’iniezione si prelevano i 10 ml del campione con siringa in vetro con attacco Luer Look. Si carica l’intero volume nel loop dello strumento interponendo un filtro per siringa. Si posizione la valvola a due vie su "inject" e si avvia il programma per la raccolta automatica delle frazioni.

Condizioni operative del sistema di purificazione in GPC:

La frazione da 0 a 100 ml viene scartata, da 100 a 200 ml si raccoglie per l’analisi, da 200 a 300 ml viene scartata.
I 100 ml della frazione raccolta per l’analisi vengono trasferiti in un pallone da 250 ml con collo smerigliato e concentrati su Rotavapor con temperatura del bagnomaria a 35 °C e vuoto a 220 mbar. Si porta a piccolo volume e poi si tira a secco in corrente di azoto.

Analisi gas-cromatografica

L’estratto purificato viene ripreso con 2 ml, misurati con pipetta tarata da 2 ml di grado A, di solvente costituito da una miscela acetone/n-esano in rapporto 1:1. Per l’iniezione si preleva un m l del campione con microsiringa da 10 ml.

Condizioni operative per l’analisi gas-cromatografica con rivelatore ECD:
  1. 180 °C per 0 min.;
  2. incremento di 3 °C/min. fino a 250 °C;
  3. 250 °C per 10 min.;
  4. incremento di 10 °C/min. fino a 260 °C;
  5. 260 °C per 15 min.;

Condizioni operative per l’analisi gas-cromatografica con rivelatore FPD:
    1. 180 °C per 0 min.;
    2. incremento di 3°C/min. fino a 250 °C;
    3. 250 °C per 10 min.;

Nota: In presenza di elevate concentrazioni di analita, tali da comportare l’uscita di scala del picco, la soluzione di estratto purificato viene nuovamente tirata a secco e poi ripresa con una quantità di miscela acetone/n-esano superiore a 2 ml.

Espressione dei risultati

La concentrazione della soluzione del campione iniettata nel gas-cromatografo si ottiene per confronto con uno standard esterno secondo la formula:

dove
CSC = concentrazione della soluzione del campione in m g/ml
AC = area del picco del campione
AST = area del picco dello standard
CST = concentrazione dello standard in m g/ml

Da questa si ricava la concentrazione del campione (CC), in mg/Kg, con la seguente formula:

dove
CC = concentrazione del campione in mg/Kg
VS = volume di solvente in ml con il quale è stato ripreso l’estratto purificato

Precisione

Dovranno essere riportati i valori di ripetibilità e riproducibilità del metodo ottenuti dalle prove per la validazione.