La strategia della rapida generazione fotochimica di composti biologicamente attivi a partire da precursori fotosensibili e inattivi è un utile metodo per sondare i meccanismi di processi biologici in sistemi cellulari o subcellulari altamente organizzati. L'uso di composti fotoattivabili permette di superare i problemi associati alla lenta diffusione del substrato entro i preparati biologici, rendendo possibili misurazioni con elevata risoluzione temporale. Questa tecnica si sta inoltre dimostrando valida per l'analisi di meccanismi enzimatici in associazione alla cristallografia macromolecolare risolta nel tempo.
Nell'approccio fotochimico allo studio dei sistemi biologici, ha avuto inizialmente notevole importanza l'uso di molecole fotoisomerizzabili, composti contenenti il gruppo azobenzenico ed esistenti nelle forme cis e trans, rispetto al doppio legame N=N [34]. Le due forme stereoisomere hanno caratteristiche differenti e sono interconvertibili tra loro per effetto della luce. Composti di questo genere sono stati principalmente impiegati come agonisti di recettori acetilcolinici, verso i quali le due forme isomere hanno diversa affinità [55, 69], e come agenti leganti per cationi bivalenti, con diversa capacità chelante nelle forme cis e trans [6].
Nell'ultimo decennio hanno assunto sempre maggior importanza specie chimiche fotolisabili, in cui un gruppo di protezione è legato alla molecola di interesse (effettore) formando un complesso biologicamente inattivo. Nella maggior parte di questi composti, denominati fin dall'inizio del loro impiego "caged compounds" [49, 58], il gruppo di protezione è costituito da un o-nitrobenzile [48, 57, 72]. Questi complessi in seguito ad irraggiamento con luce ad una lunghezza d'onda compresa tra 300 e 400 nm sottostanno ad una reazione ossido-riduttiva intramolecolare dando origine all'effettore (HX o X^-) e ad un nitrosoderivato come sottoprodotto:

Spesso viene usato come gruppo di protezione il 1-(2-nitrofenil)etile in quanto la presenza di un sostituente sul carbonio a ne aumenta la sensibilità fotolitica; inoltre si forma come sottoprodotto il 2-nitrosobenzofenone che è meno reattivo della 2-nitrosobenzaldeide nei confronti dei sistemi biologici. Il più vasto gruppo di effettori è costituito dal fosfato e da nucleotidi ed altri esteri fosforici. Oltre a questi sono stati sintetizzati ed impiegati in studi biologici derivati di acidi carbossilici, di alcoli, di ammine e di amminoacidi.
Derivati o-nitrobenzilici particolari sono i caged Ca⁺⁺ nei quali il gruppo protettore è legato ad un chelante del calcio (EDTA per il DM-nitrofen e BAPTA (acido 1,2-bis-(2-amminofenossi)etano-N,N,N',N'-tetracetico) per la serie dei nitr) la cui affinità per questo elemento viene ridotta fotoliticamente.
Un altro tipo di composti di notevole importanza sono i caged H⁺. Tutti i derivati o-nitrobenzilici liberano un protone come prima fase della reazione fotolitica; perché uno di questi sia utilizzabile come caged H⁺ è però necessario che il gruppo successivamente rilasciato (X^-) sia sufficientemente acido da non legare nuovamente i protoni e non abbia particolari effetti biologici. Su queste basi è stato sintetizzato e impiegato come caged H⁺ il 2-idrossifenil-1-(2-nitrofenil)etil fosfato.
Alcuni limiti dei derivati o-nitrobenzilici, quali la bassa velocità o resa fotolitica di alcuni composti e la possibile tossicità dei sottoprodotti, hanno fatto sì che recentemente si siano ricercati altri gruppi di protezione. Sono stati sintetizzati diversi caged Pi [3]; in particolare il 3,5-dinitrofenil fosfato è stato impiegato in studi sulla glicogeno fosforilasi. Buone prospettive sembrano inoltre offerte dai derivati benzoinici dei quali sono stati ottenuti promettenti caged Pi, esteri fosforici [14, 27, 91] e carbossilici [82].

Nella sintesi dei caged compounds è possibile individuare un passaggio peculiare che consiste idealmente nella reazione di condensazione tra l'effettore ed il gruppo di protezione, anche se generalmente uno dei due gruppi, o entrambi, partecipano alla reazione in forma modificata. Nella pratica è inoltre possibile definire classi di effettori per i quali sia utilizzabile una analoga reazione di condensazione.

Uno schema sintetico che può essere potenzialmente applicato ad un grande numero di derivati o-nitrobenzilici di composti a carattere acido è stato messo a punto alla fine degli anni '80. Si rifà ad un processo già utilizzato per ottenere o-nitrobenzil-cAMP [24] ed è stato inizialmente impiegato per la sintesi di alcuni caged nucleotidi [98].
Il prodotto finale si ottiene dalla condensazione tra diazoetano sostituito con un gruppo 2-nitrofenilico ed il nucleotide fosfato come tale. Il diazocomposto può essere prodotto facilmente facendo reagire nitroacetofenone ed idrazina per formare il corrispondente idrazone successivamente ossidato con MnO₂:

Per esteri fosforici debolmente acidi come ATP e analoghi, la reazione finale viene condotta a bassi pH (circa 4) in solvente misto, generalmente acqua/cloroformio, e può richiedere a seconda del composto fino a ventiquattro ore. Sembra che questi tempi possano essere ridotti sostituendo il cloroformio con dietiletere. Nel caso di composti più acidi, come i nucleotidi ciclici, è necessario l'uso di un solvente omogeneo polare aprotico, generalmente dimetilsolfossido o dimetilformammide. Questo perché probabilmente la reazione con il diazocomposto procede attraverso una forma protonata dell'estere fosforico. La resa che si può ottenere con questo procedimento è in alcuni casi, e con opportuni accorgimenti, vicina al 100% [97].
Grandi pregi di questo tipo di sintesi sono l'utilizzo dell'effettore come tale, del gruppo di protezione in una forma facilmente ottenibile e la sua applicabilità generale a composti contenenti un gruppo fosforico o un altro gruppo a carattere acido in grado di reagire, sotto opportune condizioni, in modo analogo con il gruppo diazo. Sono stati ad esempio sintetizzati in questo modo caged 6-fosfogluconato [89], caged inositolo 1,4,5-trifosfato (InsP₃) [95], caged BAPTA [25] e caged fenilefrina [94] nei quali i gruppi che reagiscono con la funzione diazo sono rispettivamente quelli fosforico, nei primi due casi, carbossilico e fenolico. Possono inoltre essere facilmente ottenuti caged compounds marcati radioattivamente [59, 89]. Ci sono però situazioni in cui questa sintesi non è abbastanza specifica; ad esempio nella produzione di caged GTP(gS) il diazocomposto non discrimina tra atomi di O e di S del gruppo tiofosforico [21] e nella sintesi di caged InsP₃ reagisce con tutti e tre i fosfati. Inoltre l'uso di 1-(2-nitrofenil)diazoetano comporta sempre la formazione di una miscela di almeno due forme isomeriche per l'introduzione di un centro chirale sul carbonio a del 1-(2-nitrofenil)etil derivato. Se in molti contesti il prodotto può essere usato come tale per l'analogo comportamento fotolitico delle forme isomere [21, 59], ci sono però situazioni in cui l'impiego di un isomero puro è significativamente vantaggioso. La separazione cromatografica degli isomeri è generalmente praticabile, ma in taluni casi è preferibile ricorrere ad un diverso e più specifico procedimento sintetico [15].
Anche i caged P_i possono essere sintetizzati a partire da un diazocomposto secondo lo schema precedente [97]; in alternativa vengono ottenuti mediante fosforilazione della forma alcolica del gruppo di protezione. Tra i diversi metodi descritti [49, 58] il più utilizzato si rifà allo schema proposto da Khwaja e coll. [53] ed in particolare alla metodica indicata per la sintesi del 2-cianoetilfosfato da 2-cianoetanolo. L'alcool di partenza viene fatto reagire con o-fenilene fosforocloridato in ambiente basico per formare un diestere fosforico. Da quest'ultimo viene poi eliminata per idrolisi la porzione o-idrossifenilica:

Questo metodo consente di ottenere in poche ore con buone rese prodotti abbastanza puri. Il grado di purezza può comunque essere aumentato mediante cromatografia su colonna di DEAE-cellulosa per ridurre la contaminazione da P_i [63].
Un metodo generale per la sintesi di caged nucleotidi n fosfato (con n > 1) consiste nel produrre il corrispondente caged Pi e farlo poi reagire con una forma attivata del nucleotide n-1 fosfato. Questo sistema viene attualmente impiegato per ottenere 3,5-dinitrofenil ATP [15] e 3',5'-dimetossibenzoin ATP [91]. Diversi derivati benzoinici del fosfato possono essere sintetizzati per fosforilazione del corrispondente alcool con metildiclorofosfato [3]. Un metodo alternativo messo a punto di recente prevede la fosforilazione del benzoino, in forma di chetale etilico ciclico, mediante reazione con cianoetilfosforammidite seguita da ossidazione. L'eliminazione dei gruppi cianoetile per trattamento con alcali in metanolo e l'idrolisi in ambiente acido del chetale forniscono il prodotto desiderato. Quest'ultimo procedimento, anche se più complesso, è preferibile in particolare quando si trattino benzoini asimmetrici in quanto minimizza la possibilità di isomerizzazioni e formazione di prodotti collaterali [14].