Ai fini dello svolgimento di esperimenti di flash fotolisi è necessario un apparato strumentale in grado di produrre un flash luminoso che possegga tre caratteristiche fondamentali: una lunghezza d'onda adeguata; una energia tale da fotolisare una quantità sufficiente di caged; una durata sensibilmente inferiore rispetto ai tempi dei fenomeni oggetto d'indagine.
Le lunghezze d'onda utili ai fini fotolitici per i composti usati cadono nell'intervallo 300-360 nm. Il valore al quale si ha un massimo di efficacia varia, all'interno di questo intervallo, per i diversi composti.
Per quanto riguarda le energie emesse si può considerare come dato orientativo che con un flash di 20 mJ a 347 nm si può ottenere ATP 2 mM da caged ATP 5 mM [57]. Per uno stesso caged compounds e una stessa sorgente per la fotolisi la quantità di effettore rilasciata cresce proporzionalmente all'energia del flash. Tale energia non è però quella in uscita dallo strumento, ma quella porzione che, dopo essere stata filtrata e focalizzata, incide sulla superficie del campione. Oltre alla sorgente luminosa ha quindi importanza la parte ottica della strumentazione che deve filtrare opportunamente il raggio di luce e focalizzarlo (vengono usate lenti al quarzo) senza diminuirne significativamente l'energia alle lunghezze d'onda utili. Naturalmente, mantenendo costante la parte ottica e la geometria del campione, variazioni dell'energia in uscita producono variazioni proporzionali nella concentrazione dell'effettore. Con la stessa sorgente e lo stesso caged compound sono state ottenute rese che variano da circa l'1% [29] al 77% [26].
In relazione ai tempi dell'impulso luminoso è necessario fare alcune considerazioni. L'effettiva sincronizzazione dei processi che si vanno a studiare dipende in prima istanza dalla durata del flash necessaria a produrre una sufficiente quantità di effettore. Impulsi più brevi consentono un maggior grado di simultaneità nell' innesco dei processi. D'altra parte la maggior durata del flash può determinare, a parità di energia emessa, una maggiore resa fotolitica in quanto, nell'intervallo di tempo durante il quale sono illuminate, le molecole del composto fotosensibile possono sottostare a più cicli di eccitazione.
La sorgente luminosa può essere costituita da lampade o laser [57]. Tra questi ultimi quello maggiormente impiegato è il laser a rubino. L'impulso emesso viene limitato a circa 50 ns mediante un otturatore Q. Il raggio primario è polarizzato e ha una lunghezza d'onda uguale a 694 nm; dal passaggio di questo attraverso un cristallo duplicatore di frequenza si ottiene un raggio secondario polarizzato perpendicolarmente a quello primario e con l = 347 nm. Completa l'apparato un filtro od altro sistema per separare i due raggi. Con il laser a rubino si possono ottenere energie del raggio secondario fino a 300 mJ.
Il laser a neodimio-YAG a frequenza triplicata è un altro laser a stato solido impiegato nella flash fotolisi. L'impulso finale che si ottiene ha l = 355 nm e porta un energia di 15-25 mJ in un tempo variabile da meno di 10 a 30 ns.
I laser a colorante, utilizzabili duplicando la frequenza del raggio primario, producono generalmente impulsi di maggior durata. Con alcuni di questi sistemi si sono ottenuti flash con le seguenti caratteristiche: l = 340 nm, energie di 30 mJ in tempi di 5 ms [63]; l = 352 nm, energie di 0.6 mJ in 600 ns [60]; >l = 320 nm, energie di 20-60 mJ in 1 ms [98].
Un'ultima categoria di laser, quelli a semiconduttore, produce impulsi molto brevi, anche inferiori ai 10 ns [96] con energie che possono abbondantemente superare i 100 mJ. Tra questi quello a XeCl emette a l = 308 nm, mentre quello XeF a l = 351 nm [59].
E' possibile effettuare esperimenti di flash fotolisi con lampade (a Hg o a Xe) ad emissione continua attrezzate con un otturatore [76, 92], in questi casi sono però richiesti tempi di flash nell'ordine dei secondi che ne compromettono l'uso in studi di tipo cinetico. Più adeguate sono alcune lampade a flash [71, 78] e in particolare un sistema messo a punto negli ultimi anni in grado di produrre un impulso in uscita di 100-200 mJ in tempi anche inferiori ad 1 ms [77]. Questo dispositivo si avvale di una lampada allo Xe che, adeguatamente filtrata, produce un emissione nell'intervallo 300-400 nm. Con un singolo flash è possibile ottenere ATP in concentrazioni fino a 1 mM da caged ATP 2 mM.
Da un confronto tra laser e lampade si nota immediatamente la capacità dei laser di produrre impulsi con energie sufficienti in tempi molto più brevi. A questo proposito il vantaggio teorico di una maggior sincronizzazione è da valutarsi in relazione ai tempi degli eventi successivi all'assorbimento dell'energia luminosa. Il raggio emesso dai laser risulta inoltre più facile da orientare, modellare e focalizzare. La monocromaticità dei laser, pur diminuendone la versatilità, costituisce un vantaggio in quanto evita la dissipazione di energia in zone dello spettro non utili e sotto certi aspetti indesiderate. Nettamente a sfavore degli apparati laser sono i costi sia d'acquisto, fino a 10 volte superiori a quelli di una lampada, sia di mantenimento.

Il primo evento di una reazione fotochimica è l'assorbimento di un quanto di luce da parte di una molecola con passaggio di un elettrone dall'orbitale in cui si trovava ad uno ad energia superiore. Gli stati eccitati che possono così venirsi a creare (stati di singoletto S1,S2 ... nel caso sia mantenuta la molteplicità di spin elettronico, e stati di tripletto T1, T2, ... in caso contrario) sono tra di loro e rispetto allo stato fondamentale S0, specie con differenti strutture e reattività. La molecola eccitata si trova, in ogni caso, in una condizione di minor stabilità rispetto allo stato fondamentale corrispondente e possiede perciò una tendenza intrinseca sia a liberare nuovamente l'eccesso di energia, sia ad utilizzarlo in reazioni chimiche.
La reazione fotochimica di un caged compound dà tipicamente origine all'effettore libero, quindi attivo, e ad un sottoprodotto generalmente affine al gruppo di protezione. Questo avviene, di norma, per rottura del legame che unisce l'effettore alla restante parte della molecola, in una reazione le cui caratteristiche dipendono principalmente dal gruppo di protezione.
Per i derivati o-nitrobenzilici la reazione di base è una ossido-riduzione interna fotoindotta, caratteristica di tutti i sistemi aromatici contenenti un gruppo nitro in orto ad un carbonio benzilico legato ad almeno un idrogeno. Come risultato si ha la riduzione del nitro gruppo a nitroso e l'inserzione di un ossigeno sul carbonio a. In assenza di un gruppo uscente sul carbonio benzilico si ha l'addizione di un OH; è questo ad esempio il caso della reazione della o-nitrobenzaldeide ad acido o-nitrosobenzoico:

Lo spettro di assorbimento dello ione aci-nitro presenta un picco poco al di sopra dei 400 nm, (406 nm per quello derivante dalla fotolisi di caged ATP), lunghezza d'onda alla quale il caged di partenza ha in genere un basso coefficiente di estinzione molare. Rilevando l'assorbimento del campione a questa l è quindi possibile seguire la comparsa ed il successivo decadimento dell'intermedio. Tale passaggio è stato sperimentalmente individuato nella fotolisi di composti diversi come caged nucleotidi [98] e caged carbamilcolina [60, 96].
Il decadimento dello ione aci-nitro e la comparsa dei prodotti finali della reazione sono stati analizzati in modo approfondito nella fotolisi di 1-(2-nitrofenil)etil ATP [98]. In questo studio sono state valutate le cinetiche dei seguenti eventi:

Il sottoprodotto di questa reazione, generalmente 2-nitrosoacetofenone, tende a reagire con i gruppi SH delle proteine; inoltre essendo insolubile in acqua può determinare un intorbidimento del campione ed interferire con analisi di tipo spettroscopico. Questi effetti possono essere neutralizzati aggiungendo tioli idrofilici come ditiotreitolo (DTT) o glutatione (GSH) che competono con i gruppi SH proteici e formano con il nitrosocomposto un addotto solubile i cui coefficienti di estinzione molare sono e380=850 M^-1cm^-1, e347@660 M^-1cm^-1.
Diverso è il principio che sta alla base dei caged Ca⁺⁺. In questo caso il Ca⁺⁺ viene rilasciato perché la reazione fotochimica diminuisce l'affinità del chelante. Nella serie dei nitr questo si ottiene con la generazione di un gruppo chetonico elettron attrattore a partire dal gruppo benzilico legato ad un benzene del BAPTA. La ridistribuzione elettronica che ne segue fa aumentare sensibilmente la costante di dissociazione del BAPTA per il Ca⁺⁺. Per il nitr-5 la reazione è la seguente:

Il 3,5-dinitrofenolo non mostra particolare reattività nei confronti di sistemi biologici, ma il suo assorbimento, che si estende fino al visibile e ha un picco a 400 nm (e=2800 M-1cm-1), è ancora abbastanza alto a l tali da poter interferire nella fotolisi del caged quando venga usata una lampada a flash allo Xe [15].

Una terza possibilità è poi quella di determinare la velocità di comparsa dell'effettore con metodi specifici. Per i caged Ca⁺⁺ si utilizzano indicatori per il Ca⁺⁺ come l'antipirilazo III [47], per i caged protoni indicatori di pH come il rosso fenolo [45]. Per alcuni effettori si possono utilizzare test biologici come la dissociazione dell'actomiosina per l'ATP [58], variazioni di corrente di membrana per il Ca⁺⁺ [33], risposta di canali ionici per cGMP [50].
Dai dati ottenuti per i vari caged compounds è risultato che la velocità della reazione fotolitica dipende, oltre che dal tipo di effettore, da caratteristiche proprie del gruppo protettore e da fattori quali pH, forza ionica, temperatura.
La presenza di sostituenti sul carbonio benzilico (generalmente CH₃) determina un miglioramento della velocità di fotolisi sia per il caged ATP che per la carbamilcolina; in quest'ultimo caso poi, il gruppo carbossile appare più efficace di quello metilico. Anche la presenza di gruppi metossi nelle posizioni 4 e 5 dell'anello benzenico sembra favorire la reazione. Questa variante è generalmente impiegata per caged cGMP e caged cAMP le cui corrispondenti forme non sostituite hanno velocità circa 200 volte inferiore [71].
Un fattore che influenza fortemente la velocità di rilascio dell'effettore è il pH (Figura 1). Tutti gli esteri fosforici mostrano una dipendenza del primo ordine dalla [H⁺] nell'intervallo di pH 6-9; a pH superiori la reazione diventa indipendente. Andamento diverso si ha per la caged carbamilcolina ed in particolare per il derivato 1-(2-nitrofenil)etilico, in cui il gruppo protettore è lo stesso del caged ATP, che mostra un minimo a pH 9 ed un netto aumento a valori più alti. E` questo un chiaro indice del fatto che il decadimento dell'intermedio aci-nitro, determinante la velocità di entrambe le reazioni, avviene secondo meccanismi diversi nei due casi.

Studi effettuati con il caged ATP hanno evidenziato la dipendenza della reazione fotolitica dalla temperatura e dalla forza ionica del mezzo (I); per quest'ultimo fattore è stata ricavata empiricamente la relazione log k = 1.67 - 0.445 log I [57]. L'influenza della [Mg⁺⁺] sembra essere caratteristica di caged ATP e analoghi in quanto non si manifesta per caged P_i, ADP, InsP₃.
L'efficienza del processo fotolitico dipende, per quanto riguarda il composto, dalla sua capacità di assorbire luce, cioè dal suo coefficiente di estinzione molare (e) alla lunghezza d'onda della luce utilizzata, e dalla sua resa quantica (Q_p). Quest'ultima è definita come il numero di molecole di prodotto formate per quanto di luce assorbito. La definizione del Q_p è un processo complesso per la difficoltà nella valutazione dell'energia luminosa effettivamente assorbita dal composto in questione. La determinazione diretta di questo valore è stata effettuata per molti composti, come caged carbamilcolina, caged P_i, caged Ca⁺⁺, e con diversi metodi [1, 49, 60, 94]. In alternativa si può ottenere il Q_p per confronto con un caged compound a Q_p noto, illuminando un campione che contenga entrambi i composti e rapportando le quantità di effettori ottenute [15, 95, 97]. In Tabella 1 sono riportati alcuni dei valori determinati.
Da studi condotti inizialmente sull'ATP, il Q_p per gli esteri fosforici risultava incrementato dalla presenza di un sostituente metilico sul carbonio a. Costituiva una eccezione il fosfato per il quale l'efficienza fotolitica era analoga per le due forme. Nel caso della carbamilcolina è invece l'aggiunta di un gruppo carbossilico a migliorare il rendimento del caged. E' quindi difficile fare considerazioni generali sulle caratteristiche di un ideale gruppo di protezione, anche per la carenza di studi sistematici in questo senso. Un interessante lavoro svolto con caged ammine dimostra però che sostituenti presenti sul carbonio benzilico e sull'anello benzenico influenzano fortemente i valori di Q_p [11].
La percentuale di fotolisi ottenuta con un singolo flash dipende però da diversi altri fattori quali la durata e l'intensità dell'impulso luminoso, la geometria del campione e la concentrazione del caged compound. I valori ottenuti possono essere inferiori od anche superiori a quelli attesi in base al Q_p. Ai fini pratici risulta quindi necessario determinare sperimentalmente l'efficienza fotolitica nelle condizioni usate. La quantità di effettore rilasciata può essere valutata analiticamente oppure dall'intensità dell'assorbimento dell'intermedio aci-nitro. All'interno di un definito protocollo sperimentale le quantità di prodotto dipendono dalla concentrazione iniziale del caged e dall'intensità dell'impulso luminoso. Come riferimento si consideri che con un singolo lampo sono state ottenute variazioni di ATP fino a 5 mM a partire da concentrazioni di caged ATP 10 mM e utilizzando 1-(2-nitrofenil)etil fosfato 5 mM il salto di concentrazione del P_i arriva a 1.5 mM. Variazioni inferiori, dell'ordine di 10 mM, sono state ottenute per i nucleotidi ciclici, sia per il loro basso Q_p, sia per le minori concentrazioni iniziali di caged (~100 mM) dovute alla loro bassa solubilità. Con i caged H⁺ si possono produrre salti di pH di circa 1 unità a partire da 1 mM di 2-idrossifenil-1-(2-nitrofenil)etil fosfato [52] o 300 mM di acido 4-formil-6-metossi-3-nitrofenossiacetico [45].
Per i caged Ca⁺⁺ i parametri di velocità e resa sono da considerarsi riferiti non tanto alla reazione fotolitica in quanto tale, ma piuttosto al rilascio del calcio. Sia per la serie dei nitr che per il DM-nitrofen la cinetica della fotolisi può essere seguita spettrofotometricamente grazie alle differenze di assorbimento del caged prima e dopo il flash [1], o seguendo il decadimento dell'intermedio aci-nitro [47]. I risultati così ottenuti, confrontati con misurazioni cinetiche del rilascio del calcio effettuate con indicatori specifici, mostrano che non vi sono differenze tra le velocità dei due processi. Le quantità di calcio rilasciate dipendono in modo drastico dalla differenza tra le costanti di dissociazione del chelante prima e dopo la fotolisi. Nella Tabella 2 vengono riportate queste ed altre caratteristiche per il DM-nitrofen e per il nitr-5, uno dei più interessanti elementi della serie nitr [1, 47].

Una importante caratteristica per i caged Ca⁺⁺ è discriminare tra Ca⁺⁺ e altri cationi, in particolare Mg⁺⁺; in questo il nitr-5 risulta nettamente superiore al DM-nitrofen. D'altra parte la minor selettività del DM-nitrofen lo rende utilizzabile anche come caged Mg⁺⁺.
Altra differenza evidente è la variazione della costante di dissociazione tra prima e dopo la fotolisi; il valore drasticamente più alto per il DM-nitrofen comporta che con questo si possano ottenere aumenti nella concentrazione del calcio fino a 50-100 mM, mentre per il nitr-5 tali valori sono inferiori a 10 mM.
I derivati benzoinici presentano elevatissime velocità di fotolisi. Il tentativo di determinarla con un time resolved spettrometro seguendo l'aumento dell'assorbimento a ~315 nm, dovuto alla comparsa del fenilbenzofurano, ha portato a concludere che tale velocità deve essere > 105 s^-1 in quanto supera i limiti di risoluzione temporale dello strumento [14]. Da calcoli di tipo meccanicistico effettuati per degli esteri fosforici del benzoino sembra si raggiungano anche valori di 108 s^-1 [27]. Anche se dati precisi in merito sono ancora scarsi, l'efficienza fotolitica appare buona e sembra essere migliorata dalla presenza di gruppi metossi nelle posizioni 3' e 5' sia per esteri fosforici che carbossilici [82]; per il dimetossibenzoin fosfato (DMB caged P_i) è riportato un Q_p=0.78 [14]. Le quantità di effettore che si ottengono con un singolo flash sono comunque limitate [91] probabilmente a causa del basso assorbimento di questi composti alle l efficaci per la fotolisi: e347=170 M-1cm-1. L'uso di luce ad una lunghezza d'onda di 320 nm, alla quale aumenta l'assorbimento del composto (e320=620 M-1cm-1), risulta però anche meno efficiente; in questo caso diminuiscono probabilmente le transizioni utili per la lisi del caged.
Il 3,5-dinitrofenile sembra essere un buon gruppo di protezione per il P_i che viene rilasciato rapidamente (k>104 s^-1) e con buone rese (Q_p=0.67), ma non per composti come l'ATP con il quale la fotosensibilità risulta inferiore di almeno cento volte [15].