La diffrazione dei raggi X è da tempo un utile strumento per lo studio della conformazione di molecole allo stato cristallino. Con questa tecnica è stata determinata la struttura tridimensionale di macromolecole biologiche anche molto complesse come enzimi e virus. Fino a pochi anni fa i tempi impiegati per la raccolta di un numero sufficiente di dati di diffrazione da un singolo cristallo era anche di più giorni; questo rendeva impossibile lo studio di meccanismi di reazione in cui è necessaria la determinazione della struttura di intermedi e stati di transizione con tempi di vita spesso compresi nell'intervallo tra il secondo ed i picosecondi.
L'avvento del sincrotrone come sorgente di radiazione X estremamente intensa associata all'impiego di tecniche per la stabilizzazione degli intermedi (variazioni di pH, crioenzimologia, uso di substrati lenti o mutanti meno reattivi) ha consentito l'analisi di questi ultimi, in particolari casi, mediante la diffrazione di un fascio di raggi X monocromatico.
La necessità di avvicinare ulteriormente i tempi di esposizione del cristallo a quelli degli eventi biochimici ha portato alla rivalutazione del metodo di Laue che è attualmente quello principalmente adottato [37, 38, 64, 65, 73] grazie anche all'aumentata capacità elaborativa dei calcolatori impiegati per l'analisi delle immagini di diffrazione. L'uso della radiazione policromatica del sincrotrone (la banda impiegata va in genere da 0.2 a 2.5 Å), assieme a rilevatori altamente sensibili consente oggi la raccolta di un set sufficiente di dati in tempi compresi tra i ns ed i ms utilizzando una serie di impulsi di raggi X. E' stato inoltre dimostrato che anche un solo impulso, della durata di 120 ps, è sufficiente a dare informazioni strutturali utili anche se, con le potenze prodotte dagli attuali sincrotroni, ancora incomplete.
Tra gli aspetti da esaminare prima di affrontare un esperimento di cristallografia macromolecolare risolta nel tempo è essenziale quello della valutazione delle proprietà catalitiche dell'enzima nel cristallo rispetto a quelle dell'enzima in soluzione. Infatti, a causa della diversità delle condizioni impiegate e delle restrizioni imposte dal reticolo cristallino, l'attività biologica nei due stati può essere diversa sotto vari aspetti quali velocità di catalisi e affinità per i substrati [79]. Particolarmente utile a questo scopo si è dimostrata la microspettrofotometria. Questa tecnica consente anche di seguire nel cristallo la cinetica di interconversione tra intermedi otticamente rilevabili e la loro dipendenza da fattori controllabili quali pH, temperatura, presenza di effettori o inibitori. L'individuazione delle condizioni e dei tempi di accumulo di un intermedio è essenziale ai fini di esperimenti di diffrazione dei raggi X. Le immagini di diffrazione che si ottengono sono infatti una somma dei contributi delle strutture di tutte le molecole del cristallo durante il tempo che intercorre tra l'inizio e la fine dell'esposizione. Nonostante si stia cercando di migliorare la capacità di separare l'insieme dei dati nelle varie componenti, attualmente è ancora necessario che una specie sia nettamente predominante nel cristallo per poterne determinare le caratteristiche strutturali. Per poter seguire otticamente la reazione in contemporanea a studi diffrattometrici è stato sviluppato un sistema per l'uso combinato di un apparato per raggi X e di un microspettrofotometro [37, 65].
Un altro elemento cruciale in lavori ad alta risoluzione temporale è l'innesco della reazione. Questo deve essere il più possibile rapido rispetto ai fenomeni analizzati ed uniformemente distribuito nel cristallo in modo da ottenere una buona sincronizzazione dei processi nei vari siti attivi. La diffusione dei substrati nel reticolo cristallino, anche con tecniche di mescolamento rapido, richiede solitamente tempi troppo lunghi e può inoltre creare nello stesso seri effetti di disordine temporaneo. In genere è quindi necessario fare prediffondere i reagenti in condizioni di non attività ed innescare poi la reazione con rapide variazioni di parametri quali pressione o temperatura, oppure per fotoattivazione. Quest'ultima, in particolare per reazioni veloci, è il metodo che offre migliori risultati.
Alcuni caged compounds come caged GTP e DNP-caged P_i sono già stati usati proficuamente in questo contesto. In particolare i derivati benzoinici, per la loro elevata velocità di fotolisi, sembrano offrire buone prospettive. In alternativa all'uso di caged substrati è possibile impiegare un caged enzima. Un esempio di tale approccio è fornito da studi sulla chimotripsina la cui capacità catalitica è stata bloccata legando al sito attivo un gruppo inattivante fotosensibile.
Il flash luminoso determina sempre un riscaldamento con un conseguente aumento di disordine nel cristallo. Questo fenomeno deve essere attentamente valutato sia per quanto riguarda l'aumento assoluto di temperatura, sia per la possibile formazione di gradienti termici nello spessore del cristallo. Moffat et al. hanno compiuto una approfondita analisi del problema, in particolare in riferimento al sistema della proteina gialla fotoattivabile [65]. I tempi necessari alla riequilibrazione termica, valutati in alcuni ms, possono determinare l'impossibilità di ottenere dati chiari negli istanti immediatamente successivi al flash che possono essere di grande importanza per la comprensione del meccanismo della reazione.
Nonostante le interessanti possibilità offerte da questa tecnica, gli studi di cristallografia macromolecolare risolta nel tempo per l'analisi di meccanismi enzimatici sono ancora pochi. Di seguito vengono descritti quelli che fanno uso di caged compounds.

La glicogeno fosforilasi è un enzima piridossal fosfato dipendente che catalizza la fosforilazione del glicogeno per formare glucoso 1-fosfato. In studi cristallografici tesi a delucidarne il meccanismo catalitico si usò in un primo tempo il 1-(2-nitrofenil)etil fosfato. Grazie ai dati ottenuti con radiazione X monocromatica si poté stabilire il sito di legame del caged P_i e la struttura dei prodotti di fotolisi. La reazione del 2-nitrosochetone, sottoprodotto della reazione fotolitica, con i gruppi SH determinava però una modificazione della proteina che poteva causarne l'inattivazione. L'aggiunta di tioli in quantità sufficienti a neutralizzare questo effetto (25 mM come il caged P_i) portava alla rottura del cristallo [37].
Più recentemente è stato impiegato DNP-caged P_i il cui sottoprodotto fotolitico, 3,5-dinitrofenolo, non sembra interagire con l'enzima. Con questo composto, in esperimenti di controllo effettuati utilizzando una sorgente di raggi X monocromatica da laboratorio, il rilascio di una quantità di P_i sufficiente a innescare la reazione catalitica è stato ottenuto con una serie di flash ognuno della durata di 1 ms prodotti da una lampada allo Xe. Utilizzando poi la radiazione del sincrotrone ed il metodo di Laue sono stati ottenuti in tempi molto più brevi set di dati di diffrazione che dovevano consentire un'analisi ad alta risoluzione temporale del passaggio del complesso enzima-substrato a enzima-prodotto. Dall'esame delle mappe di densità elettronica sembra però che, anche dopo un'ora di tempo dal teorico innesco, la reazione non si sia verificata. Secondo gli autori il fatto può essere attribuito ad una scarsa liberazione fotolitica del P_i nelle condizioni usate che erano leggermente diverse rispetto a quelle degli esperimenti condotti in laboratorio [73].