Le catene b esistono generalmente come dimeri b₂ e catalizzano la condensazione di indolo e L-serina a L-triptofano, denominata reazione b:

L'associazione delle subunità a e b nel tetramero determina un aumento delle velocità delle reazioni parziali rispettivamente di 100 e 30 volte e una affinità per i substrati maggiore di 1 o 2 ordini di grandezza [61]. A migliorare ulteriormente l'efficienza catalitica del complesso a₂b₂ concorre il fatto che l'indolo, prodotto dalla reazione a, non sembra diffondere nell'ambiente, ma è convogliato direttamente verso il sito attivo b per diventare substrato della reazione b. Secondo una ipotesi supportata da dati strutturali, il passaggio avviene attraverso un canale intramolecolare che collega i siti attivi [22].
Le influenze reciproche tra le subunità comprendono anche regolazioni di tipo allosterico che conseguono all'interazione dell'enzima con substrati od altri leganti [61, 62].

La triptofano sintasi da Escherichia coli è quella sulla quale è stato condotto il maggior numero di studi funzionali. La forma cristallina che ne è stata ottenuta non è però adeguata a studi strutturali mediante diffrazione di raggi X. Cristalli del tetramero a₂b₂ utili a questo scopo sono invece stati prodotti utilizzando l'enzima da Salmonella typhimurium [44]. La struttura tridimensionale del complesso è stata determinata con una risoluzione di 2.5 Å.
Le quattro catene polipeptidiche appaiono disposte quasi linearmente nella sequenza abba a formare una struttura della lunghezza complessiva di 150 Å. Le subunità a sono pertanto separate e poste all'estremità del complesso; ognuna interagisce con una sola di quelle b che si trovano al centro del tetramero strettamente associate tra loro. L'ampia superficie di contatto tra le catene a e b adiacenti è in accordo con le reciproche influenze rilevate da un punto di vista funzionale; l'associazione di leganti ad una subunità è in grado di determinare nell'altra variazioni delle affinità per il substrato e delle velocità di catalisi. Un esempio è costituito dal DL-a-glicerolo-3-fosfato che, legandosi alla catena a, altera la distribuzione all'equilibrio degli intermedi della reazione tra L-serina e subunità b. Questi effetti sono verosimilmente dovuti a variazioni strutturali che si trasmettono da una zona all'altra del tetramero. Studi fisici e cinetici hanno evidenziato come anche l'attivazione reciproca che consegue all'associazione dei monomeri a al dimero b₂ sia accompagnata da variazioni conformazionali.
Determinando la struttura dell'enzima legato all'inibitore competitivo indolo-propanolo-fosfato è stato localizzato il sito attivo della catena a; questo si trova vicino alla superficie di contatto con la adiacente subunità b.
Ogni monomero b è costituito da due domini strutturali di dimensioni analoghe. L'ubicazione del sito catalitico, nel quale è legato il PLP, è stata individuata all'interfaccia dei due domini, vicino al centro della subunità.
I siti attivi a e b di due subunità adiacenti distano uno dall'altro 25 - 30 Å e appaiono collegati da un tunnel intramolecolare che partendo dal sito a si sviluppa lungo la superficie di contatto dei due domini della catena b fino al sito catalitico b. Le caratteristiche di idrofobicità e le dimensioni di questo tunnel ne fanno un passaggio ideale per la migrazione interna dell'indolo dal sito di formazione a a quello b di utilizzo.

La reazione b è quella più studiata e meglio chiarita tra le due catalizzate dal complesso tetramerico della triptofano sintasi [62]. E', dal punto di vista chimico, una b sostituzione in cui il gruppo OH del carbonio b della L-serina viene rimpiazzato dall'indolo prodotto dalla reazione a.
La partecipazione del PLP come coenzima ha consentito, grazie alle sue caratteristiche cromoforiche, l'individuazione spettroscopica di una serie di intermedi coenzima-substrato che si formano durante il processo. La sequenza di questi intermedi proposta per la reazione e le relative caratteristiche spettroscopiche sono riportate nello schema 1.
In assenza di substrato il PLP forma una base di Schiff con l'e -ammino gruppo della lisina 87. Alle forme tautomeriche enolimminica e chetoenamminica di questo composto vengono attribuite le due bande di assorbimento evidenziate per l'oloenzima, centrate a 412 e 350 nm.
Quando viene aggiunta L-serina il suo gruppo amminico si addiziona alla base di Schiff interna formando una gem-diammina, ES I, molto instabile; la successiva espulsione del residuo lisinico dà origine all'aldimmina esterna ES II, più stabile della specie precedente. Questo intermedio ha un assorbimento massimo a 422 nm ed è caratterizzato da una forte fluorescenza con un massimo di emissione a 510 nm. Il passaggio successivo è la rimozione di un protone dal carbonio a della L-serina con formazione del chinonoide ES III e la successiva deidrossilazione del carbonio b per dare nuovamente una base di Schiff: l'a-amminoacrilato ES IV.
Nella reazione della L-serina con il dimero b₂ si accumula come intermedio stabile l'aldimmina ES II, mentre con il complesso a₂b₂ questa decade rapidamente formando ES III ed ES IV.
La trasformazione di ES II nei composti successivi comporta verosimilmente delle variazioni strutturali a livello del sito attivo b, che risultano termodinamicamente sfavorevoli nel dimero b₂ e favorevoli nel complesso a₂b₂.
Nella reazione tra il tetramero e la L-serina, all'equilibrio si ha uno spettro complesso dovuto al contributo di più intermedi con un massimo di assorbimento a 350 nm che viene attribuito ad una forma enolimminica dell'amminoacrilato ES IV.
Oltre che dalla presenza delle subunità a l'equilibrio tra gli intermedi è influenzato da altri fattori quali il legame di effettori allosterici alle subunità a, il pH, la temperatura, l'organismo d'origine e lo stato fisico dell'enzima. Relativamente a quest'ultimo fattore sono stati condotti studi comparativi [68] che dimostrano, oltre alla competenza catalitica dell'enzima nello stato cristallino, la comparsa nel cristallo di intermedi enzima-substrato analoghi a quelli che si formano in soluzione, la conservazione degli effetti modulatori esercitati dai leganti alla subunità a e la sensibilità al pH. Rispetto alla reazione condotta in soluzione sono però presenti, in alcuni casi, differenze nella cinetica e nella distribuzione degli intermedi all'equilibrio attribuibili alle forze di impacchettamento del reticolo cristallino.
La presenza dell'indolo fa procedere la reazione oltre l'intermedio ES IV verso la sintesi dell' L-triptofano. L'indolo, probabilmente attivato dall'enzima, porta un attacco nucleofilo al carbonio b dell'amminoacrilato con formazione di un intermedio chinonoide ES V poco stabile. Dalla successiva protonazione del carbonio a si ottiene l'amminoacido finale legato al PLP a formare una base di Schiff. L'attacco a questo composto da parte dell'e-ammino gruppo della lisina 87 porta alla liberazione dell' L-triptofano e alla riformazione dell'enzima libero.

L'influenza sulla reazione b di leganti delle subunità a, già da tempo riconosciuta, e quella del pH, evidenziata recentemente nell'enzima cristallino [68], sono state analizzate più dettagliatamente in un lavoro svolto con triptofano sintasi da Salmonella typhimurium in soluzione [5, 67]. In questo studio è stata in particolare valutata la distribuzione all'equilibrio degli intermedi della reazione tra L-serina e complesso a2b2, in funzione di pH, temperatura, cationi monovalenti, anione fosfato e la presenza di DL-a-glicerolo-3-fosfato, un analogo del substrato delle subunità a, l'indolo-3-glicerolo-fosfato
Il rapporto tra le quantità delle due specie predominanti all'equilibrio, aldimmina esterna ES II (l_max=422 nm) e amminoacrilato ES IV (l_max=350 nm), può essere seguito spettrofotometricamente e dipende dalla variazione della concentrazione di H⁺ nel modo indicato in Figura 2.