2 - La validazione

2.	La validazione di un metodo di prova

La validazione di un metodo analitico è il processo attraverso il quale si stabilisce, tramite studi di laboratorio, che le prestazioni caratteristiche del metodo sono adeguate per l’applicazione che se ne intende fare. In genere i parametri da considerare sono: specificità, accuratezza, precisione, linearità, range, limite di rivelabilità, limite di determinazione, robustezza. Nell’affrontare uno studio per la validazione di un metodo specifico è innanzitutto opportuno definire un protocollo che indichi quali parametri valutare, le prove da svolgere e i metodi statistici per l’analisi dei dati. Nella pratica è in genere possibile strutturare il lavoro sperimentale in modo tale da valutare più parametri con le stesse prove. Gli studi effettuati, i risultati, l’analisi dei dati e le conclusioni devono essere riportati in un rapporto finale.

2.1 SPECIFICITÀ

La specificità è la capacità di un metodo di individuare selettivamente un determinato analita in presenza delle altre sostanze contenute nel campione da analizzare. La mancanza di specificità di una singola procedura analitica può essere compensata da procedure complementari.
Un criterio di specificità per una determinazione cromatografica è che sia almeno 1,5 la risoluzione tra due picchi adiacenti calcolata secondo la formula

dove

t_R = tempo di ritenzione

t_W= larghezza del picco alla linea di base misurata in unità di tempo.

È bene produrre nella documentazione per la validazione un cromatogramma che dimostri una buona risoluzione tra i picchi degli analiti ricercati e quelli della matrice.

2.2 ACCURATEZZA

L’accuratezza è il grado di concordanza tra il valore misurato e il valore accettato come vero. Può essere determinata con uno dei seguenti metodi:

utilizzando materiali di riferimento certificati.

Consiste nell’applicare la procedura d’analisi ad una matrice identica a quella oggetto di studio contenente quantità note e certificate di analita. L’accuratezza verrà determinata per confronto tra il valore sperimentale medio, con relativo intervallo di confidenza, e quello certificato.
La principale limitazione all’uso di questo tipo di approccio è la difficoltà di reperire le matrici in esame certificate per l’analita che si intende ricercare. Enti che forniscono materiale certificati sono: l’SRM (Standard Reference Material), l’NBS (National Bureau of Standard) e il BCR (Bureau Center Reference).

per confronto con procedure analitiche alternative.

Il confronto può essere fatto con un metodo di riferimento normato di cui sia definita l’accuratezza. Il grado di accuratezza del metodo in studio sarà determinato dal confronto tra le medie dei dati ottenuti applicando i due metodi ad uno stesso campione.
Una modalità alternativa consiste nello stabilire il "valore vero" della concentrazione dell’analita contenuto nel campione attraverso l’utilizzo di più metodi analitici differenti tra loro e confrontandolo poi con il risultato ottenuto con il metodo in esame.
La difficoltà principale nell’applicazione di questa metodologia è rappresentata dalla necessità di disporre contemporaneamente di più metodi riconosciuti idonei, sostanzialmente differenti tra loro, e tutti altrettanto validi per la matrice e l’analita in esame.

mediante l’analisi di matrice bianca e aggiunte.

La tecnica consiste nell’aggiungere alla matrice in studio sicuramente priva dell’analita ricercato, lo stesso a concentrazioni comparabili a quelle normalmente riscontrate nei campioni reali. L’accuratezza può essere valutata confrontando, per ogni concentrazione, il valore medio misurato e la quantità di analita aggiunto o calcolando la percentuale di recupero.

Impiegando il metodo delle aggiunte standard.

Questa nota metodologia viene utilizzata quando non sia possibile reperire la matrice in studio sicuramente priva dell’analita.

In riferimento alle ultime due metodologie indicate è importante sottolineare il fatto che le aggiunte devono essere effettuate prima di qualsiasi operazione analitica, anche quella di presa dell’aliquota da saggio.
Come criterio generale l’accuratezza dovrebbe essere valutata effettuando un minimo di 9 determinazioni su di un minimo di 3 concentrazioni.

2.3 PRECISIONE

Per precisione si intende il grado di concordanza tra i risultati ottenuti da una serie di prove indipendenti condotte sotto condizioni definite, applicando uno stesso metodo analitico su uno stesso campione omogeneo. Può essere espressa come varianza, deviazione standard o deviazione standard relativa (coefficiente di variazione) di una serie di risultati. Comprende i concetti di ripetibilità e riproducibilità.

2.3.1 Ripetibilità

È il grado di concordanza tra i risultati ottenuti da una serie di prove indipendenti effettuate da uno stesso operatore, con la stessa apparecchiatura e in un breve intervallo di tempo. Per la determinazione della ripetibilità di un metodo analitico dovrebbero essere effettuate un minimo di 9 prove su un minimo di 3 concentrazioni.
Spesso, come ad esempio quando si impiegano tecniche cromatografiche, è opportuno valutare la ripetibilità strumentale. A questo proposito alcuni autori indicano di effettuare un minimo di 10 misure e di considerare accettabile una deviazione standard relativa non superiore all’1%.

2.3.2 Riproducibilità

È il grado di concordanza tra i risultati ottenuti da una serie di prove indipendenti effettuate da operatori diversi in laboratori diversi.
Oltre alla riproducibilità così definita, è possibile valutare una "riproducibilità interna al laboratorio" o "precisione intermedia" ottenuta da prove effettuate nello stesso laboratorio, ma in diverse condizioni (diverso operatore, diverse apparecchiature, lungo intervallo di tempo).

2.4 LINEARITÀ

La linearità di un metodo analitico è la capacità di produrre risultati direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita nel campione.
Viene determinata effettuando prove ad un minimo di 5 (6 per alcuni autori) concentrazioni nell’intervallo di applicabilità del metodo con un minimo di 3 (4) repliche. I risultati vengono riportati in grafico e valutati visivamente e con tecniche statistiche quali il calcolo della retta di regressione, del coefficiente di regressione, del valore dell’intercetta y, di indici di bontà dell’adattamento. Il parametro più frequentemente utilizzato è il coefficiente di correlazione per il quale è generalmente richiesto un valore superiore a 0,99 perchè si possa assumere la linearità del metodo.
La condizione di linearità, anche se auspicabile, non è indispensabile; nel caso non la si possa ottenere deve però essere identificata una funzione adeguata per il calcolo delle concentrazioni.

2.5 RANGE

Il range o campo di applicazione è l’intervallo di concentrazioni dell’analita all’interno del quale il metodo è applicabile con un adeguato livello di accuratezza e precisione.
Viene normalmente dedotto dai dati delle prove di accuratezza, linearità, e precisione.

2.6 LIMITE DI RIVELABILITÀ

Il limite di rivelabilità di una procedura analitica è la più piccola quantità di analita contenuta nel campione che può essere individuata in modo statisticamente significativo.
Può essere determinato in uno dei seguenti modi:

basandosi sul rapporto segnale/rumore. Viene ottenuto confrontando i risultati forniti da campioni con basse concentrazioni di analita con quelli di matrici prive dello stesso e calcolando la concentrazione alla quale il rapporto segnale/rumore assume il valore considerato accettabile (generalmente 3).
basandosi sul rapporto tra deviazione standard della risposta e pendenza della curva di calibrazione. Anche in questo caso il valore considerato accettabile è normalmente 3, per cui il limite di rivelabilità viene espresso dalla formula 3s/S. s può essere stimato basandosi sulla deviazione standard calcolata su di un minimo di 5 misure su una matrice priva di analita.

Quando si facciano stime o estrapolazioni di valori è poi bene verificare il limite di rivelabilità analizzando un adeguato numero di campioni con concentrazioni di analita vicine al limite stesso.

2.7 LIMITE DI DETERMINAZIONE

Il limite di determinazione di una procedura analitica è la quantità minima di analita contenuta nel campione che può essere determinato con un livello accettabile di accuratezza e precisione.
Può essere ricavato analogamente al limite di rivelabilità basndosi sui rapporti segnale/rumore o deviazione standard della risposta/pendenza della curva di calibrazione; il valore considerato accettabile per tali rapporti è in questo caso 10.
Valgono le stesse considerazioni svolte per il limite di rivelabilità.

2.8 ROBUSTEZZA

La robustezza di una procedura analitica è una misura della sua capacità di restare insensibile a piccole, ma deliberate, variazioni dei parametri strumentali o analitici del metodo stesso.
Anche se viene solitamente indicata come parametro per la validazione, la robustezza può essere più convenientemente valutata, tramite la realizzazione di un disegno sperimentale, in fase di messa a punto del metodo.