Come primo passo dell’iter di validazione del metodo si ritiene opportuno valutare alcuni parametri strumentali quali la linearità, la ripetibilità e la riproducibilità della risposta gas-cromatografica. Le prove di linearità devono essere eseguite per ogni miscela di principi attivi, mentre è sufficiente valutare ripetibilità e riproducibilità su una sola miscela per ciascuno dei rivelatori.

4.1.1  Linearità

Il procedimento di seguito indicato deve essere svolto per ogni miscela di principi attivi.
Si utilizzano 6 soluzioni standard con concentrazioni dei principi attivi il più possibile equidistanti nel range analitico dello strumento determinato dalle condizioni definite nel metodo. Per ogni concentrazione si effettuano 4 misure. I dati vengono analizzati svolgendo i passaggi di seguito indicati indipendentemente per ogni principio attivo.
Si costruisce un grafico riportando il valore delle aree dei picchi in funzione delle concentrazioni e si calcola la retta di regressione con il metodo dei minimi quadrati e il relativo coefficiente di correlazione. La linearità della risposta viene valutata visivamente e dal valore del coefficiente di correlazione.
Nel caso non si possa assumere la linearità sull’intero range potrebbe essere opportuno suddividerlo in sottointervalli in modo tale che all’interno di ognuno di questi si ottenga una buona linearità. I limiti di ogni sottointervallo dovranno essere chiaramente dichiarati e, in fase di applicazione del metodo, la concentrazione dello standard utilizzato come riferimento esterno per il calcolo della concentrazione del campione dovrà rientrare nel medesimo sottointervallo del campione stesso.

4.1.2  Ripetibilità

La ripetibilità della misura viene valutata per ogni rivelatore effettuando con una miscela di standard 6 iniezioni consecutive. Dai dati ottenuti si calcola per ogni principio attivo la deviazione standard e la deviazione standard relativa (RSD). Come valore di ripetibilità si può utilizzare la media delle RSD dei vari analiti contenuti nella miscela impiegata.
Nel caso si riscontri una scarsa ripetibilità della misura strumentale sarà opportuno considerare l’impiego di uno standard interno da aggiungere prima di effettuare l’iniezione gas-cromatografica.

4.1.3  Riproducibilità

La riproducibilità viene determinata in modo del tutto analogo a quanto fatto per la ripetibilità effettuando però le 6 iniezioni non in modo consecutivo, ma in giorni diversi. La miscela utilizzata viene conservata in frigorifero.

4.2.1  Prove da eseguire

• Bianco della matrice: per ogni tipo di matrice l’intera procedura analitica viene eseguita su 3 aliquote della matrice sicuramente priva dei principi attivi ricercati. Per ogni aliquota si effettuano 3 misure cromatografiche.

• Prove di recupero: utili per la determinazione di più parametri, devono essere eseguite con ogni miscela di standard su ogni tipo di matrice. Alla matrice priva dei principi attivi ricercati si aggiunge, dopo macinazione, una miscela dei principi attivi ognuno ad una definita concentrazione. Sul campione viene eseguita l’intera procedura analitica e la concentrazione e la relativa percentuale di recupero vengono determinate, per ogni principio attivo, per confronto con uno standard esterno.
  Le aggiunte vengono effettuate con miscele concentrate di principi attivi in modo tale da riprodurre nelle matrici 6 diverse concentrazioni corrispondenti a 1 - 1,5 - 2 -2,5 -3 - 4 volte il limite di determinazione "teorico" per ogni analita della miscela calcolato come la concentrazione che produce un segnale cromatografico pari a 10 volte il rumore di fondo della matrice. È necessario però verificare che nel range di concentrazioni così individuato rientrino i valori dei limiti massimi di legge consentiti per ogni principio attivo nella matrice in esame e i valori più frequentemente riscontrati in base all’esperienza. In caso contrario sarà opportuno scegliere concentrazioni diverse a quelle indicate e più adeguate.
  Per ogni concentrazione dopo l’aggiunta si prelevano 3 aliquote su ognuna delle quali si esegue l’intero procedimento. Le 3 aliquote devono essere processate parallelamente e dallo stesso operatore. Per ogni aliquota si effettuano 3 misure gas-cromatografiche; le iniezioni devono essere effettuate in ordine casuale.
  È bene che le prove con aggiunte a concentrazioni diverse vengano svolte dallo stesso operatore, lasciando trascorrere tra una e l’altra il più breve tempo possibile e, in generale, in condizioni il più possibile uniformi.
  Per ogni singola concentrazione le prove di recupero possono essere riassunte nel seguente schema:

Concentrazione	Aliquota	Iniezione
1	1	1
		2
		3
	2	4
		5
		6
	3	7
		8
		9

• Prove per la determinazione della riproducibilità descritte nel paragrafo relativo.

4.2.2  Specificità

La possibilità di individuare un principio attivo e determinarne la concentrazione è subordinata alla assenza di picchi interferenti dovuti alla matrice o ai solventi impiegati nell’analisi. Questa condizione viene verificata confrontando i bianchi della matrice con i cromatogrammi della matrice addizionata ad una concentrazione di analiti vicina a quelle più frequentemente riscontrate in base all’esperienza. Nel caso si presentino picchi parzialmente sovrapposti si deve valutare se la risoluzione tra il picco del principio attivo e il picco interferente è sufficiente a permettere la determinazione. In presenza di picchi completamente sovrapposti o comunque non sufficientemente risolti, non sarà possibile la determinazione del principio attivo.
Da esperienze precedenti si è, ad esempio, constatato che la pesca presenta un picco che si sovrappone a quello del Tetradifon; questo analita non può quindi essere determinato in questa matrice con questo metodo.
Non si ritiene necessario fare un bianco dei solventi in quanto eventuali picchi dovuti ad impurezze comparirebbero già nei bianchi delle matrici, subendo queste l’intero processo.
In tutti i passaggi seguenti vengono analizzati indipendentemente i dati relativi ad ogni singolo principio attivo.

4.2.3  Linearità

I dati di concentrazione calcolati dalle prove di recupero vengono riportati in grafico in funzione delle concentrazioni vere e si calcola la retta di regressione con il metodo dei minimi quadrati. Oltre ai coefficienti della retta si calcolano le relative deviazioni standard. I valori di intercetta e coefficiente angolare vengono poi confrontati tramite il test t di Student, rispettivamente con 0 e 1. Un eventuale significatività di t, calcolato per un livello di confidenza del 95%, per l’intercetta e/o per il coefficiente angolare, indicano la presenza di errori sistematici rispettivamente costanti e/o proporzionali. Della presenza di tali errori si dovrà tenere conto nel calcolo per la determinazione delle concentrazioni. Se necessario si dovrà considerare la possibilità di ricorrere al metodo delle aggiunte.
Sui dati derivanti dalle prove di recupero si applica l’ANOVA nested utilizzando i valori di percentuale di recupero. Si valuta la significatività della varianza tra concentrazioni e tra aliquote.

4.2.4  Accuratezza

Se dall’ANOVA la percentuale dei recuperi risulta non dipendere significativamente dalla concentrazione (cioè la varianza tra concentrazioni non è significativa), sarà possibile calcolare una percentuale media di recupero, e relativo intervallo di confidenza, sull’insieme dei dati; si otterrà in questo modo un unico indice di accuratezza. Se la percentuale di recupero risultasse invece dipendere significativamente dalla concentrazione, lo stesso calcolo dovrà essere svolto singolarmente per ogni concentrazione e per ognuna di queste si avrà un livello diverso di accuratezza.

4.2.5  Ripetibilità

Se la percentuale di recupero non dipende significativamente dalla concentrazione, il valore di ripetibilità del metodo può venire espresso indifferentemente come deviazione standard ottenuta dalla varianza tra aliquote calcolata con l’ANOVA o come RSD corrispondente. Nel caso la percentuale di recupero dipenda dalla concentrazione è più corretto indicare la ripetibilità come media delle RSD calcolate sui dati di ogni singola concentrazione.

4.2.6  Limite di rivelazione

Viene ottenuto in base al rapporto segnale/rumore assumendo come limite di rivelazione la concentrazione alla quale tale rapporto assume valore 3.
Il valore del rumore di fondo viene ricavato come media dai vari cromatogrammi dei bianchi della matrice. Nel calcolo è necessario poi considerare la percentuale di recupero a questi livelli di concentrazione.

4.2.7  Limite di determinazione

Viene ottenuto in base al rapporto segnale/rumore assumendo come limite di rivelazione la concentrazione alla quale tale rapporto assume valore 10.
Valgono le stesse considerazioni svolte per il limite di rivelazione.

4.2.8  Riproducibilità

La riproducibilità non è dipendente dalla matrice o dal principio attivo, ma è legata all’influenza di fattori esterni sul metodo; per questo si ritiene sufficiente valutarla su un solo tipo di matrice e, in teoria, su di un solo principio attivo. Analogamente a quanto fatto per ripetibilità e riproducibilità strumentali, si è però scelto di utilizzare una miscela di principi attivi per uniformità con le prove precedenti; questo consente inoltre di avere un maggior numero di dati e verificare l’effettiva indipendenza della riproducibilità dall’analita. I risultati ottenuti dall’elaborazione dei dati per ogni singolo principio attivo possono poi essere mediati per ottenere un singolo valore di riproducibilità del metodo.
Nell’ambito dello studio di questo parametro si ritiene opportuno cercare di dare un peso a quelle che sono presumibilmente le principali fonti di variabilità: gli operatori, i diversi tempi di esecuzione dell’analisi, la colonna per la GPC. All’interno del laboratorio gli operatori esperti nell’esecuzione dell’analisi sono tre. La colonna per GPC viene normalmente sostituita in media ogni 6 mesi e risulterebbe troppo complesso prevedere cambi più ravvicinati. In base alle considerazioni precedenti si è elaborato il seguente disegno sperimentale.
Si seleziona una matrice per la quale si sia riscontrata una buona ripetibilità e si effettua una aggiunta con una miscela di principi attivi in modo tale da riprodurre una concentrazione che si avvicina a quelle più frequentemente riscontrate nei campioni reali. Il campione viene conservato in congelatore per tutto il tempo necessario a completare lo studio. Ogni prova viene condotta su una sola aliquota del campione effettuando 3 iniezioni gas-cromatografiche.
Nell’arco dei sei mesi di vita di una colonna per GPC ognuno dei 3 operatori effettua 6 prove, ad intervalli di tempo di circa un mese, operando contemporaneamente uno rispetto all’altro. Nei successivi 6 mesi, dopo il cambio della colonna per GPC, si ripetono le stesse prove con le medesime modalità. Per ogni principio attivo contenuto nella miscela utilizzata i dati possono essere rappresentati in due matrici 3 x 6 (operatori x giorni) ognuna relativa ad una colonna per GPC. In ogni cella della matrice vengono riportati i 3 valori di concentrazione ottenuti dalle 3 iniezioni.
Ai dati si applica l’ANOVA. Valutando con un f test le varianze tra colonne, tra operatori e tra giorni si determina la significatività dei diversi fattori. La varianza totale diminuita della componente tra iniezioni, legata alla ripetibilità della misura strumentale, e le corrispondenti deviazione standard e RSD sono utilizzabili come indici di riproducibilità del metodo.
La documentazione relativa alla determinazione dei parametri per la validazione andrà messa a disposizione dell’Ente accreditatore (SINAL).